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輕鬆了解四種主要的
IHC 間接呈色檢測方式

免疫組織化學染色 (Immunohistochemistry, IHC) 中的呈色檢測方式 (Chromogenic detection) 仰賴於能夠將可溶性染劑轉化為不溶性色素沉澱物的酵素。

這些酵素通常與二級抗體結合,二級抗體則會與目標蛋白專一性一級抗體結合;另外,也可使用直接帶有酵素標定的一級抗體。最為常用的酵素包括能將 DAB (3,3'-Diaminobenzidine) 染劑轉化為棕色產物的 HRP (Horseradish peroxidase) 酵素,以及能將 AEC (3-Amino-9-ethylcarbazole) 染劑轉化為紅色產物的 AP (Alkaline phosphatase) 酵素。

由於呈色檢測方式具有更好的訊號放大效果,因此一般而言呈色檢測會比螢光檢測更加靈敏。並且,與螢光基團不同,呈色檢測方式所生成的色素沉澱物具有光穩定性,這使得呈色檢測的染色切片能夠穩定保存多年。再者,有別於需要專門光源與濾片的螢光檢測方式,呈色檢測僅需要一般標準顯微鏡即可觀察訊號。但不可否認地,呈色檢測方式所需時間比螢光檢測更長,因其包含了更多的孵育 (Incubation) 與阻斷 (Blocking) 步驟。

如今有四種主要的 IHC 間接呈色檢測方式被廣為使用,包含基於生物素 (Biotin) 的 ABC (Avidin-biotin complex) 與 LSAB (Labeled streptavidin-biotin) 方式,以及基於非生物素的聚合物 (Polymer) 檢測方式,例如微量聚合物與聚合物檢測法。

ABC (Avidin-biotin complex) 檢測法

ABC 檢測法仰賴於標定有生物素的二級抗體、以及標定有酵素的抗生物素蛋白 (Avidin)??股锼氐鞍拙哂信c生物素結合的特性,且為四價分子,因此能在偵測目標上形成巨大的呈色反應複合物,具有訊號放大的效果。早期的 IHC 實驗間接呈色方式多半採用 ABC 檢測法。

LSAB (Labeled streptavidin-biotin) 檢測法

如今,大多數的 IHC 實驗間接呈色檢測方式則採用 ABC 方法的變體 — LSAB (Labeled streptavidin-biotin)。LSAB 方法使用鏈黴抗生物素蛋白 (Streptavidin) 取代 ABC 方法中的抗生物素蛋白。這個改變能大幅減少非專一性結合的情形,因為相較於抗生物素蛋白,鏈黴抗生物素蛋白沒有醣基、且具有更為中性的等電點。

我們提供多款【LSAB IHC 呈色檢測試劑套組】,內含所有呈色反應必須試劑與二抗,能應用於小鼠或兔子目標蛋白偵測?;蛘吣部梢宰杂山M裝、挑選感興趣的呈色反應相關產品,包含:生物素標定二級抗體 (Biotin conjugated secondary antibodies)、AP 或 HRP 酵素標定鏈黴抗生物素蛋白 (HRP- or AP- labeled streptavidin)、以及呈色劑 (Chromogenic substrate kits)。

Polymer 聚合物檢測法

對於以生物素為基礎的檢測方式來說,關鍵挑戰在於內源性生物素可導致某些組織(例如腦)出現顯著的背景染色。福馬林固定與石蠟包埋雖然可降低內源性生物素干擾,然而抗原修復過程又會導致內源性生物素曝露。在冷凍切片中,內源性生物素是一個顯著的問題。雖然可以使用生物素阻斷液的額外處理步驟來降低背景值,然而基於非生物素的聚合物檢測法的出現,提供了研究者們另一種可能性。

早期的聚合物檢測法使用的是葡聚醣 (dextran) 骨架,上面連接有多個酵素分子和二級抗體。優化後的微聚合物 (micro-polymer)/緻密聚合物 (compact polymer) 檢測法則使用較小型的檢測複合體,聚集性較低,能提供更好的組織穿透性,對於富含有內源性生物素的組織來說,是較好的呈色選擇,能提供更高的靈敏度、與較低的背景值。

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多重染色 (Multicolour detection)

若您對同時偵測多種不同目標蛋白感興趣,則可以使用不同顏色的呈色劑進行染色檢測。多重染色通常需要使用不同宿主物種來源的一級抗體,並且除非目標蛋白表現量夠高,否則不要使用直接標定有反應酵素的一級抗體。

我們提供的多重染色試劑套組,至多可同時偵測 3 種不同目標蛋白。查看【IHC 多重染色試劑套組】產品說明。

 

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